抗体工程的新纪元 —— SELEX技术

王全立 邵宁生（军事医学科学院野战输血研究所）
詹林盛、孙红琰、刘晓达（军事医学科学院基础医学研究所）

回顾20世纪，分子生物学及其相关学科的发展给科学研究和人类生活带来了日新月异的变化，同时也更新了一些传统概念。比如，自20世纪30年代以来，人们一直认为"所有的酶都是蛋白质"。1986年，Lerner等首次研制成功催化水解羧酸酯的抗体，称之为抗体酶（Abzyme）。1987年，Cech等发现了具有催化活性的RNA分子，称之为核酶（Ribizyme）。新近又发现了特异切割RNA的DNA分子，称之为脱氧核酶（DNAzyme）。现在，可以给酶下这样的定义：“酶是生物体内一类具有催化活性和特殊空间构象的生物大分子物质，包括蛋白质和核酸等”。

抗体是机体免疫系统中最重要的效应分子，具有结合抗原、结合补体、中和毒素、介导细胞毒、促进吞噬和通过胎盘等功能，发挥抗感染、抗肿瘤、免疫调节与监视等作用。抗体的研究始于18世纪末，即1890年德国学者Von Behring证明免疫动物血清中存在抗毒素（抗体）。随后又相继发现了凝集素、沉淀素、溶血素、溶菌素和补体结合素等。

随着DNA结合蛋白研究的深入，受组合化学、抗体库和随机噬菌体肽库技术的启发，Gold等于1990年构建了随机核酸库并从中筛选出与靶蛋白特异结合的核酸配基，命名为指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment）。目前已从核酸库中筛选出多种与蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物、金属离子等特异结合的配基并应用于临床治疗和诊断。为此，我们提出这样的设想：核酸（脱氧核酸）能否作为抗体分子而替带免疫球蛋白？能否在体外合成抗体分子而改变抗体生产的传统途径，开创抗体工程的新纪元？

一、抗体的产生途径

抗体的产生途径有三条：一是经典途径，即通过免疫动物产生多克隆抗体；二是细胞工程途径即用杂交瘤技术生产单克隆抗体；三是利用基因工程途径表达和改造抗体。

但是，蛋白类抗体的生产与应用存在如下限制：

• 毒性抗原免疫动物承受不了，免疫原性弱的难以产生抗体；

• 杂交瘤产生于鼠，治疗应用受限（HAMA）；异源抗体在诊断中产生非特异性反应（假阳性），还受到类风湿因子和自身抗体的干扰；

• 成本高、费时费事，罕见抗体需大量筛选才能得到；

• 克隆株（细胞）的有效保存不易，有些杂交瘤难以在体内生长；

• 批间质量不一，诊断时要重新优化；

• 体内与体外的识别特异性有差别；

• 抗体-靶相互作用的动力学参数无法依要求改变；

• 寿命有限；对温度敏感，发生不可逆变性。

二、 SELEX技术及其优越性

核酸类抗体（配基）的筛选过程称之为SELEX技术，其基本原理就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单链随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度在20～40bp左右，文库容量在1014～1015之间。由于单链随机寡核苷酸片段特别是RNA易形成发卡、口袋、假节、G-四聚体等二级结构，能与蛋白质、核酸、小肽、氨基酸、有机物，甚至金属离子结合，形成具有很强结合力的复合物。利用这一原理，将随机寡核苷酸文库与抗原或药物等靶分子相互作用，洗脱筛选出特异寡核苷酸配基（aptemer），经RT-PCR及体外转录生成新的次一级文库，再与该靶子结合。反复数个循环，即可筛选出能与该靶子特异结合的寡核苷酸片段（图1）。

随机寡核苷酸文库，特别是随机RNA文库，与现在常用的蛋白、多肽以及合成的小分子有机化合物库相比，具有如下优点：

• 作用的靶分子范围更广：对靶无限制，包括金属离子、有机染料、药物、氨基酸、复因子、糖、抗生素、核酸、碱基类似物、核苷酸、多肽、酶、生长因子、抗体、基因调节因子、细胞粘附因子、植物血凝素、完整的病毒颗粒和致病菌等；

• 筛选出的配基与靶分子的结合能力更强：甚至强于天然配基，解离常数（kd）多在pMol/L～nMol/L之间； 

• 与靶分子结合的特异性更强：能够分辨出靶分子结构上细微的差别，可以区分1个甲基或1个羟基的差别。如茶碱与其他黄嘌呤类似物咖啡因、可可碱的结构非常相似，常规的茶碱单抗检测与后二者有交叉反应，而通过SELEX技术筛选到的寡核苷酸配基只特异结合茶碱，与其他两种物质无反应，其中与茶碱的亲和力比与咖啡因的亲和力高10，000倍。通过反向SELEX筛选，可以有效减弱以至消除既与靶分子结合，又与靶分子类似物结合的寡核苷酸配基，从而筛选出特异结合靶分子的寡核苷酸配基。从混合体系中筛选某一已知或未知靶分子的寡核苷酸配基，反向SELEX技术显示出其独特的价值，比如，用于寻找特异结合某种肿瘤标志物的寡核苷酸配基，就可以用健康个体的组织细胞进行预筛选，除去与背景结合的序列，从而筛选出目的寡核苷酸配基。

• 异质性程度更高：随机寡核苷酸文库中每一条随机寡核苷酸，其随机区的每个核苷酸位置都存在四种可能性，如果随机区有n个核苷酸，那么随机序列的多样性有n4种，再加上稀有碱基或人为修饰碱基，随机序列的多样性会更多。一般随机区域的长度为30个核苷酸左右，文库的容量能达到1014～15。比同等长度的肽热温度结构多，10个nt即可形成发卡、环攀等结构单元，尤其是可以引入iso G/iso C等分子进一步增加多样性。而随机肽库因为受编码肽的基因偏性、大肠杆菌转化效率和生物系统选择的限制，其多样性有限。

• 筛选周期更短：一般只需要8～15个循环，约2～3个月时间，并且目前其筛选过程已经可以自动化。而制备单克隆抗体，如果顺利的话，至少也需要3～6个月时间。

与蛋白类抗体相比，核酸类抗体（配基）具有如下的优越性：

• 在体外而非体内（动物、细胞）条件下筛选，特性可依要求改变；

• 筛选条件不同而结果（目的物）不同，动力学参数可依体外诊断条件的要求而改变；

• 克服毒性抗原和免疫原性弱的抗原所受的限制；

• 在体外化学合成，可以保证时间、质量和数量；

• 特异性和亲和力不受组织或样品中非靶蛋白的干扰；

• 可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子，如巯基、氨基和荧光素、生物素、酶等。

• 比抗体的分子小，方便体内影像诊断和治疗。如接上硫代磷酸，可用于细胞内诊断和治疗；

• 变性与复性可逆且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输。

三、 SELEX技术在诊断学中的应用现状与展望

在SELEX技术创立不到10年的期间内，已经筛选出大量的配基并开展了应用于临床诊断的研究。凡是涉及抗体的诊断领域，几乎都可以用核酸配基代替，其应用模式包括以下几方面。

1．双位点结合试验（夹心法）

双抗原/抗体夹心法是目前最常用的诊断模式。其间，抗原/抗体即作为捕捉分子又作为检测分子。已有研究表明，核酸配基也可以作为捕捉分子和检测分子，如血管内皮细胞生长因子（VEGF）和CD4的检测。但核酸配基尚不能同时发挥捕捉和检测两方面的作用，原因是竞争结合配体（抗原）的相同部位。解决的方法有应用抗2个不同表位（非重叠位点）的核酸配基。可以通过改变筛选条件和方法或核酸库的类型（RNA/DNA）来得到；也可以通过进一步筛选配基-靶复合物来得到第二个不同的配基，尤其针对小分子抗原。另外，该模式还可以应用于抗原-抗体复合物的检测。
核酸配基可能更适合应用于单克隆抗体难以区分的结构类似物或交叉抗原的鉴别诊断，因为前者与靶抗原结合的特异性更强。如筛选出的RNA配基在4种雌类激素hTSH, hLH, hCG, hFSH之间无交叉反应，尽管该4种激素的α链相同、β链的结构相似。又如糖基化血红蛋白与正常血红蛋白的区分，一些毒品的鉴别诊断等等，应用单克隆抗体都难以解决。
筛选出具有催化活性的核酸配基用于均相检测中是非常有意义的。最近，Wilson和Szostak在DNA库中筛选出与一种荧光素前体特异结合并使其氧化发光的配基。

2．流式细胞术

流式细胞术是细胞和微球颗粒多参数分析的有力工具，以往是通过不同染色荧光素标记的单抗来实施的。核酸配基在流式细胞术中代替单抗的优越性体现在两个方面：一是结合在细胞表面上的核酸配基的半寿期比单抗长；二是不受细胞表面上Fc受体的干扰。比如，用荧光素或藻红素标记的抗CD4的RNA配基，在流式细胞仪上检测细胞表面表达的CD4分子。

3．传感器
传感器由于能快速、简便且定量检测而受到重视，但抗体介导的免疫传感器的重复使用受限，需要温和的条件以免破坏抗体的功能。而核酸配基可以在热、不同盐浓度、金属螯和剂等条件下反复变性和复性，可修饰和固化，容易标记报告基团。已有荧光标记的抗人凝血素核酸配基用于体内诊断的报道。这种传感器的另一个优点是不需要对靶分子进行标记，还可以用于体内诊断。

4．荧光偏振

在基于荧光偏振原理的小分子激素类的简便快速检测方法中，采用的是竞争性模式，其缺点是抗体介导的荧光偏振检测灵敏度低，动力学范围窄，需要精确的试剂对照。而荧光标记在核酸配基上，比抗体分子小1/10，翻滚快，荧光偏振大；结合小分子后引起构象改变，更适宜非竞争性荧光偏振试验。已有应用该技术检测人中性粒细胞弹性蛋白酶和凝血素的报道。

5．荧光淬灭

近年来，应用荧光淬灭原理建立了新型的定性与定量基因诊断方法，其特点是灵敏、特异、容易自动化。但截止目前，荧光淬灭只能用于核酸的检测。核酸配基作为桥梁可将其应用于非核酸如蛋白质等的检测。其基本设想是：当无靶分子存在时，标记二种相互淬灭的荧光素的环状配基信标与核酸配基碱基配对结合，配基信标链拉直，荧光淬灭消失。当有靶分子存在时，靶分子与其相应核酸配基的结合，引起其构型改变（非直线型），阻碍了配基信标与核酸配基的结合，荧光淬灭依然存在。籍此，可达到检测靶分子的目的。目前，此项研究正在进行之中。

6．毛细管电泳

毛细管电泳技术因其快速、灵敏、自动化和多参数分析等优点而应用范围越来越广，包括免疫学检测。基于抗体的毛细管电泳检测难以建立非竞争法，因为不易分离标记抗体与标记抗体/抗原复合物，也难以得到均一的抗体标记小分子复合物。另外，由于抗体的糖基化而呈现异常的电泳行为，不利于结果分析。German等发明了一种亲合探针毛细管电泳技术（affinity probe capillary electrophoresis, APCE），即利用荧光标记的核酸配基检测IgE，其优点是核酸配基与靶分子的结合使其构象和质量改变，导致其电泳行为的显著变化。

7． 分子开关

核酸配基在多种环境条件下可以反复变性与复性和与靶分子结合后引起构型改变的特点，预示其能够成为良好的分子开关。例如，利用AMP-核酸配基筛选出核酶，称之为配基酶（aptazymes），是一个灵敏的分子传感器。核酸配基区识别配体，催化区放大信号。抗-DNA聚合酶的核酸配基在PCR反应热启动应用中的效果优于单抗：在40下使Taq酶失活，而且对Taq、Tth、Stoffel片段均有效。还有人将核酸配基作为亲和层析的介质，优点是亲和力强，可以反复使用。

8． 蛋白质组研究

随着人类基因组计划的进展，对其功能的研究已提到日事议程，蛋白质组计划悄然兴起。虽然2-D电泳和免疫阵列是蛋白质组研究的主要工具，但核酸配基阵列有其独特的优势：
（1） 简便快速，容易形成自动化平台；
（2） 密度高，可以精确固化；
（3） 可以从化学合成得到均相的核酸配基；
（4） 坚固、长寿；
（5） 含5环尿嘧啶的核酸配基能够可逆锁定所结合的蛋白；
（6） 除亲和特异性外，还存在着交联特异性。

SELEX技术自问世以来，其技术本身发展也非常迅速，混合SELEX（blended SELEX）、复合靶子SELEX（complex targets SELEX）、基因组SELEX（genomic SELEX）等改进的SELEX技术的相继建立，使得SELEX技术的应用前景更加广阔。而寡核苷酸配基作为诊断试剂，单独或与抗体组合应用于多种诊断模式已显示出其独特的优越性，特别是可以弥补抗体在诊断领域中应用的不足。相信在不久的将来，寡核苷酸配基阵列将会成为蛋白质组研究中主要工具之一，不仅极大地促进疾病的诊断，还有助于发现新的治疗方法。

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